双光子激发荧光(TPEF)显微镜，也称为双光子显微镜，是对活体组织深层三维成像的首选方法。深度成像是TPEF显微镜固有的优势，它使用了更长的激发波长(通常是近红外波段)，因而其带来的散射比传统共聚焦显微镜中所使用的较短的可见波长更少。更长的波长同时也减少了来自散射光的背景照明，并增加了在更高深度处的对比度。目前，用TPEF显微镜可以获得1mm深度的体内大脑图像。
在荧光显微镜中，当两个独立的光子被一种介质同时吸收时，就会发生双光子激发。这需要两个合适能量的光子在这样的介质上时间和空间上同时重合;通常来说这不需要非常大的激发光子通量，当然光子通量越大， 双光子同时被吸收的概率就越大。在TPEF显微镜中，更高的光子通量会带来更高的效率，从而带来图像质量和分辨率的提升。
在TPEF显微镜中，双光子激发所需的大光子通量更多的是通过宽波段可调谐的钛宝石飞秒激光器实现的，激光器典型规格脉宽为100fs，重复频率约为80MHz，这可以给双光子显微镜带来非常高的峰值功率和大光子通量。然而，激光器较高的平均功率(在1~4瓦范围内)会由于激发波长的线性吸收引起的与介质的光热相互作用而造成热损伤。这种效应在体内成像中尤其重要，因为温度超过40ºC会导致不可逆的损伤。因此，传统的固态激光器所提供的平均功率必须被衰减才能实际应用于TPEF显微镜，峰值功率也会相应地降低。保持较低的平均功率以避免热损伤，同时缩短脉冲持续时间是一种替代的提高峰值功率的方法。这减少了光子落在介质上的时间间隔，同时提高了介质被吸收的概率。
利用先进超连续谱全光纤激光器技术得到脉冲宽度短至15fs的商业激光器。与传统的100fs激光器相比，SCH的15fs脉冲宽度可在相同平均功率水平下提供超过传统飞秒激光器7倍的光子通量。
蓝色线：飞秒激光器光谱曲线;
橙色线：1um波段百秒激光器光谱曲线;
灰色线：红色荧光蛋白DsRed吸收截面光谱
但是，巨幅提高每个时间和面积上可用光子数量对图像的真正影响是什么呢?
一、更高的激发效率，更高的图像亮度
理论上，在双光子显微镜中，图像的亮度与激发效率直接相关，而激发效率完全依赖于光子通量和荧光团的二阶非线性激发截面(GM) 。作为一个例子，我们可以尝试计算荧光蛋白mRFP在15fs激光脉宽和1050nm中波长照射下的激发效率。与100fs的激光器相比，15fs激光器具有更宽的带宽(达200nm)，可以在900到1200nm之间激发mRFP，与100fs激光器的11nm相比，这是一个更宽的光谱区域。
蓝色曲线：以1050nm为中心的15fs全光纤飞秒光纤激光器的峰值功率;
橙色曲线：以1050nm为中心的100fs光纤飞秒激光器的峰值功率;
黑色曲线：mRFP的二阶非线性激励截面(GM)
考虑到各波长的峰值功率和激发截面，可以计算出mRFP的激发效率。结果表明，与传统100fs激光器相比较，飞秒激光器15fs的脉冲宽度使得激发效率提高了50%。
二、多色同时激发
想象一下，同时成像多个波段范围的荧光团，而不必考虑选择最佳激发波长的激光器。在双光子显微镜中，使用传统的100fs激发激光器，这通常是一个复杂的，有时甚至是不可能完成的任务。傅里叶变换极限的100fs近红外固体飞秒激光器(例如钛宝石飞秒激光器、920nm光纤飞秒激光器)的光谱宽度通常在10~20nm范围内，它们只能同时激发激发光谱在10~20nm光谱范围内的荧光团。因此，若想用单台激光器去同时激发更多种类的荧光团就需要带宽更宽，脉冲更短的激光器。
飞秒激光器在提供15fs脉冲宽度的同时以1050nm为中心波长提供200nm的带宽，在这个带宽范围内 (横跨900到1200nm)的所有绿色和红色的荧光团都可以同时被这种激光器激发。这对于双光子显微镜来说，同时对多个荧光团成像成为一个可行的，实用的和简单的替代。
常见荧光探针激发波长
综上所述，光纤飞秒激光器激光器，提供15fs的脉冲持续时间和一流的高峰值功率(>200kW)，为体内样本的低光损伤激发提供了强大的工具。结合全光纤激光器的紧凑性和坚固性性，飞秒激光器成为双光子显微镜的特殊激光选择。